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François TREUSSART - ENS Cachan et Université Paris-Sud

Une introduction aux microscopies de fluorescence résolues en dessous de la limite de diffraction.


La microscopie de fluorescence a permis de grandes avancées en biologie cellulaire et tissulaire, mais elle a longtemps buté sur la limite de résolution spatiale fixée par la diffraction à quelques centaines de nanomètres.
Pourtant, des techniques permettent maintenant de dépasser cette barrière et d’imager par microscopie de fluorescence des organisations macromoléculaires et des modifications structurales à l’échelle de quelques dizaine de nanomètres, même in vivo.
Trois chercheurs, E. Betzig, S. W. Hell et W.E. Moerner, ont obtenu en octobre 2014 le prix Nobel de Chimie pour avoir développé ces nouvelles techniques. Elles ont pour point commun d’exploiter la possibilité d’éteindre ou d’allumer l’émission de molécules fluorescentes.
La méthode « Stimulated Emission Depletion » (STED), inventée en 1994 par Stefan Hell, est une technique de microscopie à balayage où au faisceau laser d’excitation de profil gaussien est superposé un faisceau de plus grande longueur d’onde transformé par un masque en un anneau d’intensité nulle dans le plan de l’échantillon. Ce deuxième faisceau, de plus forte intensité, maintient dans leur état fondamental, par émission stimulée, les molécules qu’il recouvre, limitant l’origine du signal de fluorescence au coeur de l’anneau, d’une taille théoriquement aussi petite que voulu.
Une autre approche repose (i) d’une part sur la possibilité de détecter efficacement la fluorescence d’une molécule isolée avec un microscope et un capteur sensible comme l’ont montré W.E. Moerner et M. Orrit à la fin des années 80, permettant ainsi sa localisation à quelques nanomètres près, et (ii) d’autre part sur le contrôle de la photochimie de la molécule permettant de l’éteindre et de l’allumer de manière stochastique, comme l’a montré J. Lippincott-Schwartz et E. Betzig. Ces méthodes, appelées PALM (Photoactivation Localization Microscopy), STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)…désormais implémentées sur des microscope commerciaux, sont de plus en plus utilisées en biologie.
Nous détaillerons les principes de ces méthodes et décrirons quelques découvertes surprenantes qu’elles ont permis de réaliser.

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