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Methodes expérimentales


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Offres d’emploi et stages

Préparation des échantillons

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Guillotine fonctionnant dans une chambre à humidité contrôlée (réalisation LPS)

Appareil Cryovacublock (Escaig et al) pour congélation
par slam-freezing des échantillons massifs

Lors du processus de vitrification de l’échantillon réalisé à très basse température, l’eau est transformée en glace amorphe. La méthode utilisée dépend de la taille des échantillons :
- guillotine pour les objets en suspension,
- « slam-freezing » (ou congélation sous haute pression) dans le cas de cellules entières ou d’objets massifs. Dans ce cas, il est ensuite nécessaire de réaliser des coupes fines des échantillons à l’aide d’un cryomicrotome.
L’échantillon, maintenu à la température de l’azote, est ensuite observé dans le microscope, sous de très faibles doses d’électrons.


Cryo-ultra microtome (LEICA)

Cryocoupes du matériel hydraté-congelé

La préparation de sections fines (50-100nm) du matériel hydraté congelé sous forme amorphe, sans aucune fixation chimique, ni inclusion ou enrobage dans une résine, est une technique développée initialement dans le groupe de J. Dubochet (Lausanne) (Al-Amoudi et al, (2004), voir également le site CEMOVIS ). Cette technique est parfaitement maîtrisée au laboratoire.


Cryo-coupes de la phase lamello-colonnaire de nucléosomes. Les nucléosomes (10 nm de diamètre) sont vus de face (à gauche) ou de profil (à droite) et peuvent être comparés aux structures cristallographiques (Leforestier et al, 2001)

Cryofracture

La cryofracture est une méthode utilisée depuis longtemps en biologie pour étudier l’ultrastructure de la cellule. Elle est également beaucoup utilisée pour l’étude des systèmes membranaires. C’est une approche expérimentale qui s’est révélée très puissante pour comprendre l’organisation des phases ordonnées de l’ADN et des nucléosomes (Livolant, 1991, Livolant et Leforestier, 2000).


Appareil de Cryofracture (BALZERS BAF 400T)
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Visualisation des fragments d’ADN dans une couche de la phase colonnaire hexagonale, après vitrification et cryofracture de l’échantillon

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